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GBT18204.10-2000 游泳池水微生物檢驗方法大腸菌群測定.pdf
1范圍
本標準規定了游泳池水大腸菌群的測定方法。
本標準適用于游泳池水大腸茵群的測定。
2引用標準
下列標準所包含的條文,通過在本標準中引用而構成為本標準的條文。本標準出版時,所示版本均為有效。所有標準都會被修訂,使用本標準的各方應探討使用下列標準***新版本的可能性。
GB/T 18204. 2- 2000 公共 場所茶具微生物檢驗方法大腸菌群測定
3定義
本標準采用下列定義。
大腸菌群coliform bacteria
指一群在36'C士1C培養24 h能發酵乳糖、產酸、產氣的需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。
第一法多管發酵 法.
4儀器
見GB/T 18204. 2--2000中第3章。
5培養基和試劑
5.1乳糖蛋白胨培養液
5.1.1 成分:蛋白胨 10 g
牛肉膏 3g
乳糖 5g
氯化鈉 5g
1.6%(V/V)溴甲酚紫乙醇溶液 1 mL
蒸餾水 1000 mL
5.1.2 配法:將蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化鈉置于1 000 mL蒸餾水中加熱溶解,調pH到7.2~7.4。
5.1.2 配法:將蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化鈉置于1 000 mL蒸餾水中加熱溶解,調pH到7.2~7.4。
再加入1 mL1. 6%溴甲酚指示劑,充分混勻,分裝到含有倒管的試管中,115C高壓滅菌15 min.
5.2 伊紅美蘭瓊脂
見GB/T18204.3~-2000中第4章第2節。
5.3 革蘭氏染色液
見GB/T 18204.3- 2000中第4章第4節。
5.4染色法
見GB/T 18204.3- -2000 中第4章第5節。
6推測性試驗
6.1在2個裝有50mL三倍濃縮乳糖膽鹽培養液的大試管或燒杯內各加入水樣100mL.
6.2在10支裝有5mL三倍濃縮乳糖膽鹽培養液的試管里各加入水樣10mL。
6.3輕搖試管,使液體充分混勻,置 36"C士1C培養箱中,培養24 h。
6.4觀察每管是***產氣,如不產氣則報告為大腸茵群陰性;若有氣體產生則為推測性試驗陽性,需做進--步的證實試驗。
7證實試驗
7.1平板分離
自推測性檢驗陽性管中取一接種環培養液,接種到伊紅美藍瓊脂平板上,置36'C土1C培養箱培養18~24h,觀察菌落形態,典型的大腸菌群菌落為黑紫色或紅紫色,具有金屬光澤。
7.2復發酵試驗挑取可疑大腸菌群菌落1或2個進行革蘭氏染色,同時接種乳糖發酵管,于36"C士+1C培養箱中，培養24 h.
7.3凡乳糖 發酵管***終產酸、產氣,革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌,為大腸菌群陽性。記下證實試驗的陽性管數,查總大腸菌群(MPN)檢索表得出1000mL水樣中總大腸菌群的MPN值。
表1總大腸菌群(MPN)檢索表
第二法濾膜法
8儀器
8.1 濾器。
8.2 濾膜;孔徑0.45 um。直徑根據濾器規格,目前常用的有35 mm和47 mm兩種。
8.3抽濾設 備。
8.4無齒鑷子。
8.5 其他儀器見GB/T 18204.2--2000中第3章。
9培養基
9.1品紅亞硫酸鈉培養基
9.1.1 成分:
蛋白胨 10g
酵母浸膏 5g
牛肉膏 5g
乳糖 10g
瓊脂 10-20g
磷酸氫二鉀 3.5g
無水亞硫酸鈉 5g
5%堿性品紅乙醇溶液20 mL
蒸餾水 1000ml
9.1.2儲備培養基的制備
將磷酸氫二鉀、酵母浸膏、牛肉膏及蛋白胨加到含有900 mL蒸餾水的燒杯中,溶解后調pH值到
7. 2~7.4,加人瓊脂加熱溶解,用蒸餾水補足至1 000 mL,趁熱用脫脂棉或絨布過濾,再加人乳糖,混勻
9.1.3平皿培養基的制備
9.1.3平皿培養基的制備
將上述培養基加熱融化,根據培養基的用量,堿性品紅乙醇溶液與培養基按1↑50的比例,用滅菌另一個滅蔭空試管內.加滅菌水少許使其溶解,在沸水浴中煮沸滅菌10 min。另一個滅蔭空試管內.加用滅菌吸管吸取已滅菌的亞硫酸鈉溶液,滴加于堿性品紅乙醇溶液至深紅色褪成淡粉紅色為止。將滅菌水少許使其溶解,在沸水浴中煮沸滅菌10 min。
此亞硫酸鈉與堿性品紅的混合液全部加入已融化的儲備培養基中,并充分混勻(防止產生氣泡),立即將此種培養基適量傾人滅菌的空平皿內,待其冷卻凝固后置冰箱內備用。此培養基于冰箱中保存不宜超過兩周，如培養基已由淡紅色變成深紅色,則不能再用。
9.2乳糖蛋白胨培養液
10 操作步驟
10.1濾膜滅 菌:將濾膜放人含蒸餾水的燒杯中,煮沸滅菌三次,每次15 min。前兩次煮沸后需更換水洗滌2~3次,以除去殘留溶劑。
10.2 濾器滅菌:用121C商壓滅菌20 min或用點燃的酒精棉球火焰滅菌。
10.3 水樣過濾:用無菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分,將粗糙面向上,貼放在濾床上。固定好濾器,將X10' Pa(-0.5大氣壓)下抽濾。X10' Pa(-0.5大氣壓)下抽濾。
10.4 培養:水樣濾完后,再抽氣約5s,關上濾器閥門,取下濾器。用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣部分,移放在乳糖瓊脂分離培養基上,濾膜截留細菌面向上,濾膜應與培養基完全貼緊,兩者之間不得留有氣泡。然后將平皿倒置,放人36C士1C恒溫箱內培養18~24 h.
10.5挑取濾膜上符合下列特征的茵落進行革蘭氏染色、鏡檢。
紫紅色,具有金屬光澤的菌落;
深紅色,不帶或略帶金屬光澤的菌落;
淡紅色,中心色較深的菌落。
10.6 將革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌接種到乳糖蛋白胨培養液中.于36C士1C培養48h.產酸產氣者證實為大腸菌群陽性。
11 檢驗結果報告
計算濾膜上生長的證實為大腸菌樣的菌落數,再乘以10即為每1000mL水樣中的大腸菌群數。
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